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技術欄:磷酸化蛋白WB實驗注意事項

點擊次數:502   發布時間:2024/4/28 10:06:51

 蛋白磷酸化是一種非常重要的翻譯后加工,做信號通路必然是要檢測蛋白磷酸化的,Western blot是評估蛋白磷酸化狀態的常用方法,其實和跑正常蛋白沒什么出入,只不過孵育的是識別磷酸化的抗體。下面恒遠生物帶大家總結一下實驗中的注意要點。

一、關于磷酸化蛋白樣品
裂解液問題蛋白的磷酸化是一個非常迅速的反應,取樣品的過程要迅速,樣品要新鮮,樣品處理要在冰上操作,操作時間盡量短。用PBS洗滌細胞時,PBS一定要4℃預冷。如果是組織的話,提取蛋白時采用液氮研磨的方法,研磨器具要提預冷,保持低溫的狀態。

提取磷酸化蛋白的裂解液新鮮配制,裂解液中一定要有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑,否則即使條帶壓出來也會很淺,結果也不可信。okadaic acid,NaF是磷酸酶抑制劑。再者,還要看你檢測的蛋白磷酸化位點是什么氨基酸,如果是酪氨酸還要加1 u M的sodium vanidate即原釩酸鈉,上樣不要煮沸,煮沸可能會破壞其磷酸化位點。

二、關于WB時背景和條帶的問題
磷酸化蛋白WB時背景也往往較深,所以壓片時間要適當,不能太長或過短,太長則背景太深蓋住想要的那條帶,時間過短則可能沒有條帶或者條帶太淺。做磷酸化蛋白WB時,除了目標蛋白的條帶以外,往往會出現非特異性的條帶。磷酸化抗體不好的話,甚至會壓出非特異性的條帶,反而沒有你想要的條帶,所以壓片后,一定要根據Markers比對一下你壓出的條帶分子量是否正確。

三、關于蛋白總的表達量問題
研究完某一蛋白的磷酸化情況后也要研究一下該蛋白總的表達量。這有兩種方法,一是:相同的樣品在不同的孔中上樣兩次(可在相同的膠上,也可在不同的膠上),其一壓磷酸化蛋白,另一壓該蛋白總的表達量(包括磷酸化和未磷酸化的該蛋白),甚至還可跑另一個膠,壓內標。但是一般不建議如此做,因為這樣比較時誤差還是較大的。因此,比較公認的,也是常用的方法,即用strip液將原先結合上的磷酸化抗體及二抗洗去,然后用同一張膜壓總蛋白。然后再洗脫一次,再壓內標。

更多實驗資訊可咨詢我司業務員。上海恒遠生物科技有限公司擁有自己的實驗室,備有業的技術研發團隊,對于各種生物試劑,細胞,血清,ELISA試劑盒的研發與銷售,實驗提供免費代測服務,并提供精湛的技術服務,如果您有實驗上的問題歡迎來咨詢,為您提供業的一對一技術指導。
 

原創作者:上海恒遠生物科技有限公司

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